I. Einführung
II. Definition von oxidativem Stress

1. Das Sauerstoff-Paradoxon
2. Die antioxidativen Schutzmechanismen
3. Faktoren, die zu oxidativem Stress beitragen
4. Unausgewogene Ernährung: ein wichtiger Faktor für oxidativen Stress
5. Nutzen der Bestimmung von oxidativem Stress

III. Wie kann man oxidativen Stress erfassen?

1. Enzyme und kleine Moleküle mit antioxidativen Eigenschaften

A. Die Superoxiddismutasen (SOD)
B. Die Glutathionperoxidasen (GPx)
C. Die Thioredoxine (TRx) und die Thioredoxinreduktase (TRxR)
D. Die Hämoxygenase
E. Die Hitzeschockproteine
F. Die Karotinoide
G. Vitamin C
H. Vitamin E
I. Glutathion
J. Die Proteinthiole
K. Harnsäure
L. CoEnzym Q10
M. Die totale antioxidative Kapazität

2. Spurenelemente

A. Selen
B. Kupfer
C. Zink

3. Biologische Marker für oxidativen Stress

A. Die Lipidperoxidation
B. Oxidierte Proteine
C. 8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin

4. Der Eisenstatus

A. Freies Eisen
B. Ferritin
C. Transferrin und die Transferrin-Sättigung

5. Das Stickstoffmonoxid-Radikal

6. Die paramagnetische Elektroresonanz (EPR)

7. Andere Marker

A. Homocystein
B. Glukose
C. Die Myeloperoxidase
D. Das Fettsäureprofil

IV. Welches ist der beste Marker für oxidativen Stress?

V. Sofortige Behandlung der Blutproben und Kühlkette: zwei essentielle Anforderungen für qualitativ hochwertige Ergebnisse

VI. Ausblick auf die Zukunft: Genomik und Proteomik

VII. Schlussfolgerung

VIII. Literatur

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So bestimmen Sie Ihren oxidativen Stress

  Pincemail J.

Chief Scientific Officer - Probiox

j.pincemail@probiox.com

I. Einführung

Ohne Sauerstoff können wir nicht überleben. Der lebensnotwendige Sauerstoff bildet jedoch unter physiologischen Bedingungen in den Mitochondrien fortlaufend reaktive Sauerstoffspezies (ROS für „reactive oxygen species“), die für die Zellen sehr schädlich sind. ROS, zu denen die freien Radikalen zählen, besitzen oxidative Eigenschaften und können in der Umgebung, in der sie gebildet werden, mit einer ganzen Reihe biologischer Substrate (Lipide, Proteine, DNA, Glukose …) reagieren. Auf molekularer Ebene können ROS auch als Second Messenger fungie­ren und unterschiedliche Faktoren und Gene aktivieren, die bei der Entstehung verschiedener krankhafter Zustände eine Rolle spielen.

Um sich gegen die toxischen Wirkungen des Sauerstoffs zu schützen, hat unser Körper Vertei­digungssysteme entwickelt, die die Bildung von ROS regulieren. Dazu gehören Antioxidantien (z.B. die Vitamine A, C und E), Spurenelemente und Proteine, die das Eisen daran hindern, die ROS-Bildung in Gang zu setzen. Proteolytische Enzyme, deren Aufgabe es ist, oxidierte Sub­strate abzubauen, vervollständigen das Arsenal an Abwehrmöglichkeiten.

ROS werden auch durch Oxidantien aus der Umwelt gebildet. Unser modernes Leben konfron­tiert uns mit Umweltverschmutzung, Alkohol- und Medikamentenkonsum, längerfristiger Son­neneinstrahlung und Tabakrauchen . Diese Faktoren führen in unserem Körper ebenfalls zu einer übermäßigen ROS-Bildung, die wiederum eine Schwächung der antioxidativen Schutzmecha­nismen (Vitamine, Spurenelemente) sowie Schäden an den Zellen zur Folge hat. Die Situation wird noch dadurch erschwert, dass unsere Nahrung heute nicht mehr gesund und ausgewogen ist und uns immer weniger natürliche Antioxidantien zuführt, die für die Abwehr der schädlichen Wirkungen des Sauerstoffs erforderlich sind. Dabei ist zu erwähnen, dass auch schlecht prakti­zierte oder schlecht angeleitete intensive körperliche Belastung zu oxidativem Stress führen kann. In der Medizin kann oxidativer Stress im Rahmen operativer Eingriffe am Herzen oder den Gefäßen, Organtransplantationen oder bei Atemnot auftreten.

Oxidativer Stress wird im Allgemeinen als Missverhältnis zwischen Prooxidantien und den Schutzsystemen (Antioxidantien) definiert. Die Folge ist eine häufig irreversible Schädigung der Zellen (Abbildung 1).

Unterschiedliche Lebensgewohnheiten, genetische Voraussetzungen und die jeweilige Umwelt, in der wir leben, haben zur Folge, dass das antioxidative Potential individuell verschieden ist. Für den Erhalt eines optimalen antioxidativen Potentials ist aber auch eine gesunde Ernährung sehr wichtig. So betragen zum Beispiel die durchschnittlichen Plasmakonzentrationen an Vitamin C:
· bei einem gesunden Menschen, der gar kein Obst isst: 31,12 ± 14,88 mmol/l
· bei einem gesunden Menschen, der jede Woche drei bis vier Stück Obst isst: 36,45 ± 18,79 mmol/l,
· bei einem gesunden Menschen, der täglich drei bis vier Stück Obst isst: 48,83 ± 23,68 mmol/l (8).

Die Bestimmung von oxidativem Stress entwickelt sich derzeit zu einem der wichtigsten Aspekte im Rahmen der Vorbeugung von Krankheiten . Zahlreiche Studien (1) zeigen eine enge Bezie­hung zwischen Störungen der antioxidativen Schutzmechanismen und dem Auftreten von mehr als 200 unterschiedlichen Krankheitszuständen von der Atherosklerose über AIDS, entzündliche Erkrankungen, Diabetes mellitus und Alterungsvorgänge bis hin zum Krebs (Abbildung 2).

II. Definition von oxidativem Stress

1. Das Sauerstoff- Paradoxon

Die in den Mitochondrien ansässige Atemkette hat in der Zelle eine zentrale Funktion: Sie ist für die Umwandlung von Sauerstoff in zwei Wassermoleküle verantwortlich. Diese direkte Reduk­tionsreaktion setzt die Gegenwart von vier Elektronen voraus und wird durch ein komplexes System aus Proteinen und Enzymen (Cytochromen) möglich, die in der inneren Mitochondrien­membran lokalisiert sind. Die in den Mitochondrien ablaufenden Reaktionen können zwei unter­schiedliche, paradoxe Ergebnisse haben. Auf der einen Seite stellen sie eine wichtige Energiequelle für die Zelle dar, da bei der Reduktion des Sauerstoffs 36 Moleküle Adeno­sintriphosphat (ATP) entstehen, die ein hohes energetisches Potential aufweisen. Auf der ande­ren Seite werden etwa 0,4 bis 4 % des Sauerstoffs aufgrund eines Elektronenverlusts, der auf Störungen der mitochondrialen Atemkette beruht, nicht korrekt in Wasser umgewandelt. Die Reduktion des Sauerstoffs mit nur einem Elektron lässt reaktive Sauerstoffspezies (ROS) ent­stehen, zu denen freie Radikale wie das Superoxid-Anion und das Hydroxyl-Radikal (OH°.) gehören. Ein freies Radikal ist chemisch betrachtet ein Atom oder Molekül, dessen Struktur durch das Auftreten eines freien Elektrons gekennzeichnet ist. Dieses freie Elektron verleiht dem Atom oder Molekül eine im Vergleich zum Ausgangsatom/-molekül deutlich höhere Reaktivität. Es können auch andere, nicht radikalische Sauerstoffabkömmlinge wie Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) und Singulet-Sauerstoff (1O 2 ) entstehen. Die Bildung von ROS erfordert die Gegenwart eines Übergangsmetalls wie Eisen oder Kupfer. Diese Übergangsmetalle sind in der Chemie der freien Radikale unverzichtbare Katalysatoren (Abbildung 3).

Unser Körper bildet somit fortlaufend ROS (Abbildung 3). Durch die moderne Molekularbiologie wurde es möglich, nachzuweisen, dass ROS eine wichtige physiologische Funktion haben: In geringen Konzentrationen fungieren sie als leistungsfähige Second Messenger und haben folgende Aufgaben:

- Regulation des Phänomens der Apoptose, also des programmierten Zelltodes von Zellen, die        im Begriff sind, sich in Krebszellen umzuwandeln. (2)
- Aktivierung von Transkriptionsfaktoren (NFkB, p38-MAP-Kinase, …) die wiederum für die Akti­vierung von Genen verantwortlich sind, die bei der Immunreaktion eine Rolle spielen (3),
- Modulation der Expression von Strukturgenen, die für die antioxidativen Enzyme kodieren (4).

Die Kehrseite der Medaille ist, dass ROS, wenn sie in zu großen Mengen produziert werden, schädliche Wirkungen haben. So können sie auch bei gesunden Zellen eine Apoptose induzie­ren oder unterschiedliche Gene aktivieren, die für die Expression pro-inflammatorischer Zytokine oder von Adhäsionsproteinen kodieren. Darüber hinaus sind ROS aufgrund ihrer Instabilität besonders reaktiv und in der Lage, in den Zellen große Schäden anzurichten:
· Verursachen von Bruchstellen und Mutationen der Desoxyribonukleinsäure (DNA),
· Inaktivierung von Proteinen und Enzymen,,
· Oxidation von Zuckern (Glukose),
· Induktion einer Lipidperoxidation in mehrfach ungesättigten Fettsäuren der Lipoproteine oder der Zellmembran (Abbildung 4).

2. Die antioxidativen Schutzmechanismen

Das Gleichgewicht zwischen den positiven und negativen Auswirkungen der ROS ist sehr labil. Unser Körper reguliert die ROS-Bildung strikt und hat antioxidative Schutzmechanismen ent­wickelt, die uns vor den potentiell schädlichen Auswirkungen der ROS bewahren können. Bei diesen Schutzmechanismen handelt es sich im Einzelnen um (Abbildung 5) :
- Enzyme (Cu/Zn-Superoxiddismutase und Mn-Superoxiddismutase, Katalase, Glutathionperoxi­dasen, Thioredoxin/Thioredoxinreduktase-Redoxkette, Hämoxygenase, Hitzeschockproteine),
- Transportproteine für Eisen und Kupfer (Transferrin, Ferritin, Caeruloplasmin),
- antioxidativ wirkende kleine Moleküle (Glutathion, Harnsäure, Bilirubin, Glukose, Vitamin A, C, E, Ubichinon, Karotinoide, Flavonoide),
- Spurenelemente (Kupfer, Zink, Selen), die für die Aktivität der antioxidativen Enzyme unver­zichtbar sind.
Ein sekundäres Verteidigungssystem aus Enzymen, die die Aufgabe haben, die Anreicherung von Proteinen oder oxidierter DNA in der Zelle zu verhindern und deren toxische Fragmente abzubauen, vervollständigt das Arsenal an Schutzmechanismen gegenüber ROS (Abbildung 5).

3. Faktoren, die zu oxidativem Stress beitragen

Oxidativer Stress wird als Missverhältnis zwischen Antioxidantien und Prooxidantien definiert, wobei Letztere überwiegen (5). In vivo können mehrere biochemische Systeme für eine ver­mehrte ROS-Bildung verantwortlich sein. Ein Beispiel für eine Zunahme des oxidativen Stresses sind Veränderungen im Bereich der Elektronentransportkette in den Mitochondrien, im Rahmen des Alterungsprozesses , sowie bei allen Zuständen, die mit einem Ischämie–Reperfusions-Phä­nomen einhergehen (z.B. Organtransplantationen). Die Leukozyten-Aktivierung ist ebenfalls eine wichtige Quelle der ROS-Bildung. Fremdstoffe überführen diese Zellen aus einem ruhenden in einen aktivierten Zustand. Dabei steigt der Sauerstoffverbrauch um 400 % an. Unterschiedliche Enzym-Systeme wandeln fast den gesamten Sauerstoff in ROS um, die anschließend gesunde Gewebe angreifen können: Dieses Phänomen wird als Entzündung bezeichnet. Weitere Systeme, die für die Massenproduktion von ROS in Betracht kommen, sind die Aktivierung der Xanthinoxidase, die Hämoglobin-Oxidation, die Freisetzung von freiem Eisen, ein gesteigerter Prostaglandinstoffwechsel oder auch die Aktivierung von Endothelzellen. Darüber hinaus weisen zahlreiche epidemiologische Studien darauf hin, dass Homocystein ein unabhängiger kardiovaskulärer Risikofaktor für Herzinfarkte, zerebrale ischämiche Insulte und die Koronarmortalität ist. Einer der Wirkmechanismen von Homocystein, der das Auftreten einer Atherosklerose begünstigen könnte, ist ein direkter zytotoxischer Effekt auf die Endothelzellen, der zum Teil mit der Bildung freier Radikale im Rahmen der Oxidation von reduziertem Homo­cystein durch Eisen zusammenhängt (6, 7).

Unsere Umwelt, aber auch unsere Lebensgewohnheiten bewirken eine Zunahme des oxidativen Stresses in unserem Körper. Hier einige Beispiele:
- längerfristige UV-Lichtexposition (Sonnenbaden)
- Strahlenexposition
- Kontakt mit krebserzeugenden Substanzen (z.B. Asbest)
- Tabakrauchen (der Rauch einer Zigarette enthält 10 19 ROS)
- Medikamenteneinnahme, empfängnisverhütende „Pille“
- zu intensive oder schlecht angeleitete körperliche Belastung
- übermäßiger Alkoholkonsum
- geistiger Stress
- thermischer Stress
- Ozontherapie
- Umweltverschmutzung
- infektiöse Substanzen
- ….

4. Unausgewogene Ernährung: ein wichtiger Faktor für oxidativen Stress

Antioxidantien werden uns überwiegend über Obst und Gemüse zugeführt. Diese sind beson­ders reich an Vitaminen (A, C, E), Spurenelementen und anderen Polyphenolen. Es ist heute anerkannt, dass die empfohlene Tageszufuhr an diesen unterschiedlichen Elementen durch den täglichen Verzehr von mindestens fünf Portionen Obst und Gemüse gedeckt werden kann. Diese Menge wird im realen Alltag jedoch bei weitem nicht erreicht. Mehrere epidemiologische Studien zeig­ten, dass mehr als 20 % der Bevölkerung der Industrienationen niemals Obst zu sich nehmen. In einer Studie an 123 gesunden Probanden der Region Lüttich konnten wir diese Zahl bestätigen und zeigen, dass der Plasmaspiegel von Vitamin C bei Personen, die kein Obst zu sich nehmen, im Vergleich zu solchen, die täglich 1 bis 4 Stück Obst essen, im Mittel um 26,3 % niedriger ist (8). Das In-Mode-Kommen von Fast Food (regelmäßiger Verzehr von Hamburgern, Pizza, etc.) trägt ebenfalls und insbesondere bei jungen Menschen dazu bei, dass unsere Ernähung immer unausgewogener und an Antioxidantien ärmer wird.

Die folgende Abbildung zeigt, in welchem Ausmaß der Verzehr großer Mengen an Obst und Gemüse die zellulären Spiegel an oxidierter DNA senken kann (9). Die Bedeutung oxidierter DNA im Rahmen der Krebsentstehung ist nachgewiesen (Abbildung 6).

Abbildung 6 : Einfluss der Nahrung auf die DNA-Oxidation

5. Nutzen der Bestimmung von oxidativem Stress

Im Jahr 1991 wies die MONICA-Studie der Weltgesundheitsorganisation (WHO) ein unter­schiedlich hohes Koronarrisiko bei Menschen aus Südeuropa (Obst- und Gemüse-reiche Ernäh­rung) und solchen aus Nordeuropa (weniger reiche Ernährung) nach. Die Ergebnisse der Studie zeigen ganz eindeutig, dass das Koronarrisiko umso höher ist, je niedriger die Vitamin-C-Spiegel sind. Niedrige Vitamin-C-Spiegel sind bei der Bevölkerung Nordeuropas zu beobachten (10). Diese Beobachtungen zum Vitamin C wurden anschließend in einer großen epidemiologischen Umfrage an 1.600 Probanden bestätigt (Abbildung 7) (11).

Die vorliegenden epidemiologischen Studien zeigen in ihrer großen Mehrzahl einen engen Zusammenhang zwischen Änderungen der antioxidativen Schutzmechanismen, einem Anstieg der oxidativen Marker und dem Auftreten von mehr als 200 unterschiedlichen Krankheitszustän­den von der Atherosklerose, über AIDS, entzündliche Erkrankungen, Diabetes mellitus und den Alterungsprozess bis hin zum Krebs (Abbildung 2). Entsprechend könnte eine zusätzliche Zufuhr von Antioxidantien zur Vorbeugung dieser Erkrankungen potentiell von Nutzen sein. Die „Evidence-Based-Medicine“ hat in diesem Bereich zwar noch nicht Fuß gefasst, die einheitlichen Ergebnisse der Studien zu Antioxidantien zeigen jedoch deren potentiellen Nutzen im Rahmen der Krankheitsvorbeugung . So zeigten zum Beispiel neuere Studien, dass Vitamin E in der Lage ist, das Fortschreiten einer Atherosklerose der Karotiden zu verzögern (12, 13).

Die Kenntnis des „oxidativen Stress-Status“ ist somit für die Vorbeugung von Erkrankungen von Nutzen (14). Dank der Entwicklung spezifischer, empfindlicher, schneller und für den Routine­gebrauch geeigneter Analysemethoden ist PROBIOX SA in der Lage, eine große Zahl von Tests anzubieten, die eine Beurteilung der antioxidativen Schutzmechanismen, der Spurenelemente, des Eisenstoffwechsels (Eisen ist ein Katalysator für ROS-bildende Reaktionen) aber auch der Marker der Oxidation von Lipiden, Proteinen oder der DNA ermöglichen. Auf diese Weise kann ein unphysiologischer oxidativer Stress erkannt und durch Ernährungsempfehlungen oder die Einnahme von geeigneten Nahrungsergänzungen korrigiert werden.
PROBIOX SA entwirft und entwickelt fortlaufend verbesserte Analysemethoden für den oxidati­ven Stress. Diese Mission ist Teil einer wissenschaftlichen Revolution, die in nicht allzu ferner Zukunft zu einem deutlich individuelleren, auf den einzelnen Patienten zugeschnittenen thera­peutischen Vorgehen führen sollte. Insbesondere werden die Analysemethoden Auskunft über die Reaktion des Genoms des jeweiligen Patienten auf oxidativen Stress liefern und eine sehr genaue Beurteilung des individuellen Reaktionsvermögens auf diesen Stress erlauben.

III. Wie kann man oxidativen Stress erfassen?

Oxidativer Stress lässt sich nicht durch einen einzelnen Test bestimmen. Um ein ge naues Bild zu erhalten, benötigt man eine ganze Batterie geeigneter Analysemethoden (1).   Die zu untersuchenden Parameter lassen sich in sechs große Gruppen einteilen:

1. Enzyme und kleine Moleküle mit antioxidativen Eigenschaften

A. Die Superoxiddismutasen (SOD)

Dieses Enzym ist für die Elimination des Superoxid-Anions zuständig, des ersten toxischen Sauerstoffabkömmlings. Das Enzym bildet damit die erste Verteidigungslinie gegenüber oxidati­vem Stress. Die SOD benötigt für eine einwandfreie Funktion Spurenelemente wie Kupfer und Zink (Cu/Zn-SOD des Zytosols) oder Mangan (Mn-SOD der Mitochondrien). Es gibt auch eine extrazelluläre SOD.

Niedrige SOD-Spiegel können auf niedrigen Konzentrationen der Spurenelemente beruhen. Die SOD-Konzentrationen korrelieren jedoch nicht absolut mit denen der Spurenelemente. Bei oxi­dativem Stress zeigt die SOD zwei Verhaltensweisen (Abbildung 8). Auf mittelstark ausgepräg­ten oxidativen Stress (zum Beispiel während körperlicher Belastung) reagiert der Organismus zunächst mit einer Überexpression der SOD (15, 16). Besteht der Stress weiter fort und kommt es zu massiver Bildung toxischer ROS wird die SOD zerstört und die Konzentrationen sinken. Paradoxerweise kann eine übermäßig erhöhte SOD-Konzentration gefährlich sein, da sie in die­sem Fall die Grundlage für eine übermäßige Produktion von Wasserstoffperoxid bilden kann (paradoxe Wirkung der Antioxidantien).

Normaler Blutspiegel: 785 – 1570 IE/g Hämoglobin

B. Die Glutathionperoxidasen (GPx)

Dieses Enzym benötigt für seine einwandfreie Funktion Glutathion und Selen. Hauptfunktion ist die Elimination von Lipidperoxiden, die durch Einwirkung von oxidativem Stress auf mehrfach ungesättigte Fettsäuren entstanden sind.

Genau wie die SOD zeigt auch die Selen-abhängige Glutathionperoxidase in Gegenwart von oxidativem Stress zwei unterschiedliche Verhaltensweisen: Auf eine anfängliche Überexpression des Enzyms folgt bei permanent andauerndem oxidativem Stress die Zerstörung. Die Aktivität der GPx kann auch bei unzureichender Selenzufuhr über die Nahrung vermindert sein.

Das Verhältnis zwischen Selen-Plasmaspiegel und erythrozytärer GPx ist erst ab einem Selenspiegel unterhalb von 60 µg/l signifikant (Abbildung 9). Oberhalb dieses Wertes liegt ein Plateau vor, was darauf hinweist, dass der Bedarf des Enzyms gedeckt ist (17) .

Normale Konzentration im Blut: 30 – 55 IE/g Hämoglobin

C. Die Thioredoxine (TRx) und die Thioredoxinreduktase (TRxR)

Thioredoxine sind wie alle Proteine mit einer Thiolgruppe (-SH) Enzyme mit intrinsischer antioxi­dativer Aktivität. Sie spielen auch bei der Regulation des Immunsystems eine bedeutende Rolle (18, 19). Thioredoxin wird nach seiner Oxidation durch die Thioredoxinreduktase (TRxR), ein Enzym mit Selencystein-Gruppe am aktiven Zentrum, reduziert. Die TRxR ist auch am Abbau von Lipidperoxiden oder von Wasserstoffperoxid sowie an der Rückumwandlung des Ascorbyl-Radikals in Ascorbinsäure beteiligt.

D. Die Hämoxygenase (HO)

Das Hämoxygenase-(HO)-System besteht aus drei Isoenzymen: der induzierbaren HO-1, der konstitutiven HO-2 und der HO-3, die vor kurzem geklont wurde. In biologischen Systemen erlaubt die HO die Umwandlung von Häm in Kohlenmonoxid, Biliverdin und Eisen. Der Schutz­mechanismus der HO gegenüber oxidativem Stress ist indirekt und davon abhängig, dass sich das gebildete Biliverdin in das stark antioxidativ wirksame Bilirubin umwandelt. Darüber hinaus stimuliert das durch die HO gebildete Eisen die Bildung von Ferritin, welches ebenfalls an der antioxidativen Reaktion beteiligt ist (langfristige Wirkung). Dennoch kann die HO kurzfristig schädliche Auswirkungen haben, da eben dieses Eisen über seine katalytische Wirkung auf die ROS-Bildung auch prooxidativ wirkt (20).

E. Die Hitzeschockproteine

Diese Chaperon-Proteine (Hitzeschockproteine) wie die HSP70-Familie spielen eine wichtige Rolle bei der Translokation, Stabilisation und beim Zusammenbau von Proteinen. Sie beteiligen sich außerdem an der Reparatur von durch oxidativen Stress ausgelösten Schäden an Protei­nen. Die Hitzeschockproteine erlauben es den Zellen, sich in einem feindlichen Umfeld zu behaupten und bis zum Eintreten günstigerer Bedingungen lebensfähig zu bleiben. Die vermehrte Synthese dieser Proteine muss demnach als Anpassungsreaktion gegenüber oxidati­vem Stress gesehen werden. Dieser oxidative Stress kann unterschiedliche Ursachen haben: Thermoregulation (Hypothermie und Hyperthermie), Azidose, Energiemangel, Ischämie-Reper­fusions-Phänomen, Virusinfekt, körperliche Belastung (21).

F. Die Karotinoide

Bestimmte Karotinoide wie das Beta-Karotin werden zu Vitamin A abgebaut, das eine wichtige Rolle für das Sehen spielt. Die meisten Karotinoide und das Vitamin A reagieren mit Singulett-Sauerstoff und können auf diese Weise die Oxidation mehrerer biologischer Substrate, darunter die mehrfach ungesättigten Fettsäuren, verhindern.

Ein größerer Mangel an Vitamin A oder Retinol ist selten und tritt erst ab Werten unterhalb von 10 mg/100 ml auf. Niedrige Werte (< 28,6 mg/100 ml beim Kind und < 40,1 mg/100 ml beim Erwachsenen) entsprechen einem mittleren Risiko für einen Vitamin-A-Mangel. In der bekannten MONICA-Studie der WHO , die in 8 europäischen Ländern durchgeführt wurde, gingen Vitamin-A-Konzentrationen oberhalb von 63 - 80,2 mg/100 ml mit einem niedrigeren Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen einher (22).

Unter den aufgrund ihrer antioxidativen Eigenschaften interessanten Karotinoiden ist auch das Lycopen zu erwähnen, das in der Schale von Tomaten zu finden ist (23), sowie das Lutein, das ß-Cryptoxanthin, das Zeaxanthin, etc.

Normwerte der Vitamin-A-Plasmaspiegel: 1200 – 3700 IE/L oder 36,03 – 111 µg/dl
Normwerte der Beta-Karotin-Plasmaspiegel: 10 - 85 µg/dl
Normwerte der Lycopen-Plasmaspiegel: 10 - 33 µg/dl

G. Vitamin C

Vitamin C (Ascorbinsäure) wird nicht vom Körper synthetisiert. Seine Plasmakonzentration hängt stark von der Ernährung und von Änderungen des Blutflusses in der Leber ab (z.B. nach körper­licher Belastung). Vitamin C ist ein ausgezeichneter ROS-Fänger und kann unterschiedliche biologische Substrate (Proteine, Fettsäuren, DNA) vor einer Oxidation schützen. In physiologi­schen Konzentrationen ist Vitamin C in der Lage, die durch verschiedene ROS-Bildungssysteme (aktivierte neutrophile Granulozyten, aktivierte Endothelzellen, Myeloperoxidase) verursachten LDL-Oxidation zu verhindern. Bei seiner Oxidation zu Dehydroascorbinsäure nimmt Vitamin C vorübergehend eine intermediäre Radikalform an (Ascorbyl-Radikal), die in der Regenerierungs- Kaskade von Vitamin E aus oxidiertem Vitamin E eine wichtige Rolle spielt (Abbildung 10).

Bei oxidativem Stress wird Vitamin C verbraucht. Mehrere Studien zeigten darüber hinaus, dass Vitamin-C-Werte unterhalb von 4 mg/ml mit einem erhöhten Risiko für Herz-Kreislauf-Erkran­kungen einhergehen (10) (siehe Abbildung 8).

Trotz seiner Instabilität kann Vitamin C bei sofortiger und angemessener Behandlung der Blut­probe routinemäßig bestimmt werden.

Normwerte der Plasmakonzentrationen: 6,21– 15,18 µg/ml (Männer); 8,6– 18,8 µg/ml (Frauen)

H. Vitamin E

Vitamin E ist der Überbegriff für die Familie der Tocopherole (Alpha, Beta, Gamma, Delta). Aufgrund seines hydrophoben Charakters kann sich Vitamin E in die Fettsäuren der Zellmem­bran und der Lipoproteine einfügen, wo es eine schützende Funktion übernimmt und das Fortschreiten der durch oxidativen Stress ausgelösten Lipidperoxidation verhindert (Abbildung 11). Unter den Tocopherolen besitzen das Alpha- und das Gamma-Tocopherol (24) die stärk­sten antioxidativen Eigenschaften.

Vitamin E wird bei oxidativem Stress verbraucht. Vitamin-E-Konzentrationen unterhalb von 7 – 8 mg/ml entsprechen einem mittelgradigen Risiko für einen Mangel an diesem Vitamin in der Nah­rung. Die europäische MONICA-Studie der WHO (10) zeigte, dass die Blutspiegel an Vitamin E (nach Normalisierung in Bezug auf die Cholesterin-Spiegel) bei gesunden Männern, (40-49 Jahre), die in Regionen Europas mit niedriger Koronarmortalität leben (Schweiz, Süditalien) sig­nifikant höher sind als bei Bewohnern von Regionen mit mittelhoher (Nordirland) oder hoher Mortalität (Südwest-Finland, Schottland).

Vitamin E wird durch Lipide transportiert. Aus diesem Grund muss seine Konzentration stets für die Cholesterin-Spiegel (Verhältnis Vitamin E/Cholesterin) oder die Gesamtlipide normalisiert werden.

Normwerte der Vitamin-E-Plasmaspiegel: 8 – 15 µg/ml
Normwerte des Quotienten Vit.E/Cholesterin im Plasma: 4,40 – 7,00 µg/g

I. Glutathion

Glutathion ist ein Tripeptid, das im Kampf gegen den oxidativen Stress an mehreren Stellen in Aktion tritt. Glutathion (GSH) kann direkt mit reaktiven Sauerstoffspezies reagieren, dient aber im Wesentlichen als Substrat für die Glutathionperoxidase, die für die Elimination von Lipid­peroxiden sorgt. GSH spielt darüber hinaus eine zentrale Rolle bei der Expression von Genen , die für pro- und antiinflammatorische Proteine kodieren (Abbildung 2). Zu niedrige GSH-Kon­zentrationen haben eine Verschlechterung der Immunabwehr zur Folge.

Bei oxidativem Stress wird GSH in der Regel verbraucht. Die Bestimmung des oxidierten Glu­tathions (GSSG) und die Berechnung des Verhältnisses GSH/GSSG liefern ein genaueres Bild vom Ausmaß des oxidativen Stresses. Jones et al. (25) zeigten vor kurzem, dass es im Zuge des Alterungsprozesses (> 50 Jahre) zu einer progressiven Verringerung dieses Verhältnisses kommt. Der Quotient ist auch besonders nach intensiver körperlicher Belastung erniedrigt (Abbildung 13), bei der es zu einem Anstieg des oxidierten Glutathions kommt. Wie bereits beschrieben spiegelt diese Situation das Vorliegen von oxidativem Stress wider (26).

Normwerte der GSH-Konzentrationen im Blut: 753 – 958 µM
Normwerte der GSSG-Konzentrationen im Blut: 1,17 – 5,32 µM
Normwerte für das Verhältnis GSH/GSSG im Blut: 156 - 705

J. Die Proteinthiole

Die meisten Proteine weisen Thiolgruppen auf (-SH), die sehr leicht mit reaktiven Sauerstoff­spezies reagieren. Angesichts seiner hohen Plasmakonzentrationen kann Albumin, das eben­falls Thiolgruppen aufweist, als eines der wichtigsten Antioxidantien im Plasma angesehen werden. Dieser Test ergänzt die GSH-Bestimmung.

Normwerte der Plasmakonzentrationen: 216 – 556 µM

K. Harnsäure

Harnsäure ist das Haupt-Endprodukt des Purinstoffwechsels bei Primaten. Die Substanz weist antioxidative Eigenschaften auf und kann mit reaktiven Sauerstoffspezies reagieren, und zwar insbesondere mit dem Hydroxyl-Radikal. Harnstoff scheint in Bezug auf seine Reaktivität mit ROS das wirksamste Antioxidanz des Plasmas zu sein. Dennoch können seine Oxidations­produkte wie das Allantoin leicht selbst oxidieren und dabei toxische Sauerstoffspezies bilden.

Die Harnsäure-Konzentrationen steigen bei oxidativem Stress und insbesondere beim Ischämie-Reperfusions-Phänomen an.

Normwerte der Plasmakonzentrationen: Männer: 34 -84 mg/l; Frauen: 22 - 60 mg/l

L. CoEnzym Q 10

Ubichinon oder CoQ 10 ist für seine wichtige Funktion bei der Energieproduktion in den Mito­chondrien bekannt. Insbesondere in seiner reduzierten Form, Ubichinol–10 oder CoQ 10 H 2 , weist CoQ10 auch antioxidative Eigenschaften auf. Diese sind von daher interessant, als die Substanz wie auch das Vitamin E in der Lage ist, die Lipidperoxidation zu hemmen (27, 28). Genaue Aus­sagen zur Bedeutung von CoQ10 bei der Verteidigung gegenüber ROS lassen sich durch Bestimmung des Quotienten CoQ 10 H 2 /CoQ 10 machen (29). Darüber hinaus kann die Bestimmung von CoQ10 bei der Identifikation von Patienten mit erhöhtem Koronarrisiko von Nutzen sein (Abbildung 14).

Ghirlanda et al. (30) zeigten, dass es unter der Einnahme von Statinen, die für ihre Cholesterin-senkenden Eigenschaften bekannt sind, zu einem deutlichen Abfall der Spiegel an zirkulieren­dem CoQ 10 (+/- 40%) kommt. Statine hemmen das Enzym 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-(HMG-CoA)-Reduktase, das auf die Bildung von Mevalonat, einem für die Synthese von Cholesterin und CoQ 10 wichtigen Substrat, einwirkt.

Normale Plasmakonzentrationen: 0,40 – 1,2 µg/ml

M. Die totale antioxidative Kapazität

Mit Hilfe dieses Tests wird bestimmt, in welchem Ausmaß Vollblut oder Plasma in der Lage sind, die ROS-Bildung in einem In-vitro-System zu hemmen. Es handelt sich also um ein Screening-Verfahren, das die Summe der Einzelaktivitäten aller in diesen biologischen Milieus vorliegenden Antioxidantien abbildet (31). Es gibt mehrere Tests (LPIC, TEAC, FRAP, TRAP, ORAC, DCFH-DA* etc.), die sich durch das ROS-bildende System, die zu oxidierende biologische Zielsubstanz und das Nachweis-System unterscheiden. Der Literatur zufolge ist der TEA-Test der am wenigsten zuverlässige. Seit kurzem gibt es sehr schnelle Methoden (Bestimmung in einigen Minuten), die sich der Chemolumineszenz bedienen und eine Unterscheidung der auf hydrophi­len und lipophilen Antioxidantien beruhenden totalen antioxidativen Kapazität des Plasmas ermöglichen. Bei der Interpretation der Testergebnisse muss man allerdings sehr vorsichtig sein, da sie häufig die Spiegel der zirkulierenden Harnsäure (oder von Albumin) widerspiegeln, also des Antioxidantiums, das am bereitwilligsten mit ROS reagiert. Jede Methode hat ihre Grenzen und ja nach Wahl der Methode kann es zu einer Über- oder Unterschätzung der totalen antioxi­dativen Kapazität oder auch zu einem Ergebnis, das überhaupt nicht mit dem oxidativen Stress korreliert, kommen.

·* LPIC : Lipid peroxidation inhibition capacity
· TEAC : Trolox equivalent antioxidant capacity
· FRAP : Ferric reducing antioxidant power
· TRAP : Total radical-trapping antioxidant potential
· ORAC : Oxygen radical absorbance capacity
· DCFH-DA : Dichlorofluorescein – diacetate assay

2. Spurenelemente

A. Selen

Dieses Spurenelement ist selbst kein Antioxidanz, wirkt aber als Co-Faktor der Glu­tathionperoxidase an der Abwehr von ROS mit.

Mehrere große Studien zeigten, dass Selen -Serumkonzentrationen unterhalb von 45 – 50 µg/l, mit Koronarerkrankungen assoziiert sind (32, 33, 34).

Normwerte der Plasmakonzentrationen: 94 – 130 µg/l
(Anmerkung: Die Selenkonzentration im Serum beträgt das 1,18-Fache seiner Plasmakonzentration)

B. Kupfer

Dieses Spurenelement ist einer der essentiellen Co-Faktoren der SOD. Ebenso wie Eisen spielt es aber als sogenanntes Übergangsmetall auch eine wichtige Rolle in Bezug auf das Auslösen von Reaktionen, die zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies führen. Überhöhte Kupfer-Spiegel können demnach auf das Vorliegen von oxidativem Stress hinweisen. Mehrere Studien wiesen einen Anstieg der Kupfer-Serumspiegel im Verlauf des Alterungsprozesses nach (35).

Normwerte der Plasmakonzentrationen: 0,70 bis 1,40 mg/l

C. Zink

Auch dieses Spurenelement gehört zu den essentiellen Co-Faktoren der SOD. Die Einnahme von Zink hat langfristig die Induktion antioxidativer Proteine wie der Metallothioneine zur Folge. Zink schützt darüber hinaus die Thiolgruppen der Proteine. Es kann durch Eisen oder Kupfer indu­zierte Reaktionen, die zur Bildung von Sauerstoffspezies führen, teilweise hemmen. In diesem Zusammenhang kann die Bestimmung des Verhältnisses der Kupfer- und Zink-Blutspiegel inte­ressante Hinweise auf das Ausmaß an oxidativem Stress bei einer Person liefern.

Zinkmangel führt in der Regel zu einer höheren Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress. Eine neuere Studie zeigte, dass ältere Menschen mit degenerativen Erkrankungen ein höheres Verhältnis aus Kupfer/Zink aufweisen, als gesunde ältere Menschen (36).

Normwerte der Zinkplasmakonzentrationen: 0,70 – 1,20 mg/l
Normwerte des Verhältnisses Kupfer/Zink im Plasma: 1,14 – 1,29

3. Biologische Marker für oxidativen Stress

ROS reagieren mit einer ganzen Reihe biologischer Substrate wie Proteinen, Lipiden und der Desoxyribonukleinsäure (DNA). Oxidierte Derivate dieser unterschiedlichen Substrate sind somit Marker für das Vorliegen von oxidativem Stress.

A. Die Lipidperoxidation

Hauptangriffsziel der ROS sind die mehrfach ungesättigten Fettsäuren der Zellmembranen. Auf diese Weise entstehen Lipidperoxide (LPO), die im Plasma oder Vollblut mit unterschiedlicher Sensibilität und Spezifität bestimmt werden können (37). Allerdings lösen sich LPO in Unterpro­dukte auf, wie Malonaldehyd (MDA), 4-Hydroxynonenal, Ethan oder Pentan. Über viele Jahre wurde die MDA-Bestimmung mittels Thiobarbitursäure (TBARS-Methode) zur Beurteilung der Lipidperoxidation in vivo eingesetzt. Es ist allerdings wissenschaftlich anerkannt, dass dieser Test nicht spezifisch ist und zahlreichen Artefakten unterliegt. Heute ist es möglich, die MDA über genauere HPLC-Techniken zu bestimmen. Dennoch sollte man daran denken, dass die MDA nur einen geringen Prozentsatz (1 %) des Lipidperoxid-Abbaus widerspiegelt, und damit bei weitem kein zuverlässiger Marker für das Vorliegen von oxidativem Stress ist.

ROS können auch direkt mit den Fettsäuren reagieren. Dabei wird das 8-Epi-Prostaglandin F2 a gebildet, das zur Familie der Isoprostane gehört. Die Konzentration dieser Substanzen ist zum Beispiel im Plasma und Urin chronischer Raucher (38) deutlich höher als bei Nicht-Rauchern (Abbildung 15).

Mehrfach ungesättigte Fettsäuren sind auch essentielle Bestandteile der LDL („Low Density Lipoproteine“). Die LDL-Oxidation spielt bei der Entstehung der Atherosklerose eine große Rolle. Neuere Studien zeigten, dass die Konzentrationen an oxidierten LDL bei Patienten nach Myo­kardinfarkt gegenüber einer Kontrollpopulation deutlich erhöht waren (39). Im Allgemeinen wei­sen Patienten mit hohem kardiovaskulären Risiko (Hypertension, Hypercholesterinämie, Adipositas, Dialysepflicht) von der Norm abweichende Konzentrationen an oxidierten LDL auf (Abbildung 16). Die auf dem Nachweis konjugierter Diene basierende spektrophotometrische Bestimmung oxidierter LDL ist weniger sensibel und weniger spezifisch als neuere immunologi­sche Methoden.

Normwerte der Plasmakonzentrationen an oxidiertem LDL: 26 – 117 E/L

Die LDL-Oxidation führt zur Bildung von Antikörpern gegen oxidiertes LDL (Ab-ox-LDL). Mehrere Studien zeigten einen engen Zusammenhang zwischen einem Anstieg der Antikörper-Spiegel und der Progredienz einer Atherosklerose der Karotiden (40, 41, 42). Besonders hohe Antikör­pertiter werden regelmäßig bei Hochleistungssportlern beobachtet (43), die ein ausgezeichnetes In-vivo -Modell für oxidativen Stress darstellen (Abbildung 17).

Normwerte der Serumspiegel der Antikörper gegen oxidiertes LDL: 200 – 600 IE/l

B. Oxidierte Proteine

Proteine können in Gegenwart von ROS denaturieren, fragmentieren oder ihre Primär- oder Sekundärstruktur verlieren. Oxidative Schäden an den Proteinen (und Aminosäuren) können sich auf unterschiedliche Weise manifestieren (44, 45):
- Auftreten von Hydroperoxid-Gruppen (-OOH),
- Oxidation des Kohlenstoffskeletts der Polypeptid-Kette mit Fragmentation der Proteine und Auftreten von Carbonylgruppen,
- Oxidation der Seitenketten der Aminosäuren mit Bildung von Disulfidbrücken, Methioninsulfoxid und Carbonylgruppen. Bestimmte Aminosäuren (Phe, Tyr, His) unterliegen einer Hydroxylierung, die im Fall von Phe zur Bildung von Ortho- und Metatyrosin führt. Bei der Oxidation von Tyr kommt es zur Dimerisierung von zwei Tyrosyl-Radikalen, die zur Bildung von Ditryrosin führt.
- Bildung chlorierter (z.B. 3-Chlorotyrosin, 3,5-Dichlorotyrosin) und nitrierter Derivate (Nitro­tyrosin) bei Kontakt von Tyrosin mit dem MPO/H 2 0 2 -System bzw. dem Stickstoffmonoxid-Radi­kal (NO°).

Der Nachweis von Carbonylgruppen in oxidierten Proteinen ist die mit Abstand am häufigsten eingesetzte Technik (46). Dennoch spiegelt das Auftreten dieser Gruppen eher eine globale Änderung im Protein wieder und ist zweifellos nicht genauso spezifisch für das Vorliegen von oxi­dativem Stress wie der Nachweis von hydroxyliertem Tyr.

Normwerte der Plasmakonzentrationen

C. 8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin

ROS reagieren besonders gerne mit bestimmten konstitutiven DNA-Basen. Guanin wird auf diese Weise leicht in 8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin (8-OH-dG) umwandelt, das normalerweise durch DNA-Reparaturenzyme entfernt wird. Versagen diese Systeme kommt es zur Anreiche­rung von 8-OH-dG in der DNA (Abbildung 18), und in der Folge zu Mutationen, die bei der Krebsentstehung eine Rolle spielen (47). Die Bestimmung der 8-OH-dG-Konzentration im Urin erfordert eine Normalisierung für Kreatinin.

Normwerte im Urin: 0 – 20 µg 8OH-dG/g Kreatinin (Bestimmung mittels ELISA)

4. Der Eisenstatus

Eisen dient bei der ROS-Bildung als Katalysator. Unter physiologischen Bedingungen liegt es nicht in der freien, für diese schädlichen Wirkungen verantwortlichen Form vor. Aus diesem Grund ist die Bestimmung der Transportproteine des Eisens ein wichtiges Element der Beurtei­lung von oxidativem Stress. Zahlreiche Arbeiten weisen darauf hin, dass Übergangsmetalle wie Eisen und Kupfer beim Entstehen der Atherosklerose eine Rolle spielen. (48).

A. Freies Eisen

Das im Rahmen von klassischen Blutuntersuchungen bestimmte Serumeisen repräsentiert den Eisenpool, der an Proteine und andere Chelatbildner wie Pyrophosphate gebunden ist. Es han­delt sich dabei also nicht um das berühmte toxische freie Eisen (49, 50), das sich routinemäßig mit einigen technischen Restriktionen messen lässt. Im physiologischen Zustand ist kein freies Eisen nachweisbar.

Normwerte der Plasmakonzentrationen an freiem Eisen: 0 µmol/l

B. Ferritin

Dieses Protein stellt den Hauptspeicher für intrazelluläres nicht metabolisiertes Eisen dar und spielt damit eine zentrale Rolle für die Bereitstellung von freiem Eisen, das als Katalysator von Reaktionen dient, die zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies führen. Mehrere Studien zeigten, dass ein Anstieg des Ferritin-Spiegels (insbesondere im Bereich der Haut) eine Anpassungs­reaktion auf oxidativen Stress darstellt (51).

Normwerte der Plasmakonzentrationen: 30 – 300 ng/ml (Männer); 15 – 150 ng/ml (Frauen)

C. Transferrin und die Transferrin-Sättigung

Unter physiologischen Bedingungen wird Transferrin zu 25 bis 30 % durch Eisen gesättigt. Höhere Werte weisen darauf hin, dass Eisen in eine freie Form freigesetzt wurde. So induziert zum Beispiel ein im Rahmen einer Bypassoperation der Herzkranzgefäße eingesetzter extrakor­poreller Kreislauf aufgrund der Hämolyse der roten Blutkörperchen eine ausgeprägte Freiset­zung von Eisen. Mehrere Arbeiten zeigten, dass der Eisensättigungskoeffizient des Transferrins im Verlauf eines extrakorporellen Kreislaufs progressiv ansteigt und Werte von bis zu 80 bis 90 % erreicht, wobei es parallel zu einem Anstieg der Marker für oxidativen Stress kommt (52, 53).

Normwerte der Transferrin-Plasmakonzentrationen: 1,60 – 3,50 g/l
Normwert der Transferrinsättigung durch Eisen: 20 – 40 %

5. Stickstoffmonoxid-Radikal

Dieses besondere vom Stickstoff abgeleitete Radikal (NO°) wird von den Endothelzellen gebildet und spielt eine wichtige physiologische Rolle bei der Blutdruckregulation. Oxidativer Stress kann jedoch zu Funktionsstörungen der Endothelzellen führen, die dann ein Übermaß an Stickstoff­monoxid-Radikalen bilden. Diese können mit oxidierten freien Radikalen reagieren und für den Organismus besonders schädliche Substanzen bilden, die Peroxinitrit-Derivate (HOONOH).

NO kann nach seiner Bildung auch in Nitrite oder Nitrate umgewandelt werden. Ein Anstieg des Verhältnisses der Nitrit-/Nitrat-Plasmakonzentrationen spiegelt die Bildung von Stickstoffmonoxid wider. NO kann außerdem mit der Tyrosingruppe von Proteinen (Nitrierung) oder mit Gamma-Tocopherol reagieren. Diese Eigenschaften werden dazu genutzt, NO in biologischen Proben nachzuweisen (54, 55).

6. Die paramagnetische Elektroresonanz (EPR)

Dies ist die Technik der Wahl für die direkteste Visualisierung der freien Radikalen, die möglich ist. Freie Radikale besitzen ein ungepaartes Elektron, das sich wie ein Kreisel um sich selbst dreht und dabei ein magnetisches Feld induziert (Abbildung 19). Wird das freie Radikal in ein durch zwei starke Magneten gebildetes Magnetfeld platziert, kommt es zur Absorption von Ener­gie, die sich als Spektrum optisch darstellen lässt. Das auf diese Weise erhaltene Signal ist dann eine Art Fingerabdruck für jeden Radikal-Typ.

Darüber hinaus ist die Intensität des Signals der Menge an freien Radikalen in der untersuchten biologischen Probe direkt proportional, so dass eine quantitative Bestimmung der Bildung an freien Radikalen möglich ist. Unter Einsatz einiger technischer Raffinessen (sog. „spin traps“) lässt sich die EPR in der klinischen Routine zum Nachweis des Superoxid-Anions in Plasmaproben nutzen.

Mit Hilfe der EPR lässt sich auch das Ascorbyl-Radikal im Plasma nachweisen (Abbildung 20). Dabei handelt es sich um eine radikalische Intermediärform zwischen der Ascorbinsäure und ihrem oxidierten Endprodukt, der Dehydroascorbinsäure. Die Bestimmung des Ascorbyl-Radi­kals ist insofern interessant, als dass sie die Unterscheidung ermöglicht, ob niedrige Vitamin-C-Spiegel durch eine unzureichende Zufuhr des Antioxidantiums über die Nahrung oder durch oxi­dativen Stress verursacht sind. Gehen niedrige Vitamin-C-Plasmaspiegel mit normalen Werten für den Quotienten Vit.C/Ascorbyl-Radikal einher, weist dies auf eine geringe Vitaminzufuhr hin. Dagegen weisen (selbst normale) Vitamin-C-Spiegel im Zusammenhang mit einem niedrigen Quotienten aus Vit.C/Ascorbyl-Radikal auf das Vorliegen von oxidativem Stress hin (56).

Normwerte der Plasmakonzentrationen des Ascorbyl-Radikals: 0,28 – 0,44 willkürliche Einheiten*
Normwerte für das Verhältnis Vit.C/Ascorbyl-Radikal im Plasma: 20,73 – 39,29
(* Bestimmung mit einem Jeol FR300)

7. Andere Marker

A. Homocystein

Homocystein ist eine schwefelhaltige Aminosäure und Zwischenprodukt des Methionin- und Cysteinstoffwechsels (Abbildung 21). Auch wenn zahlreiche Laboratorien Homocystein-Konzen­trationen zwischen 5 und 15 µmol/l als normal bewerten, zeigten neuere prospektive Studien, dass sich Homocystein-Spiegel oberhalb von 6,3 µmol/l in einer Zunahme von Myokardinfarkten um 35 % äußern (Abbildung 22) (57). Jeder Anstieg der Homocystein-Spiegel um 5 µmol/l, was einem Anstieg des Plasmacholesterins um 20 mg/dl gleichkommt, erhöht das Koronarrisiko beim Mann um 60 % und bei der Frau um 80 %. Homocystein ist außerdem sehr leicht oxidierbar und bildet ROS, die - insbesondere in Gegenwart von Metallen wie Eisen oder Kupfer – LDL oxidie­ren können (6).

Normwerte der Plasmakonzentration: 5 – 15 µmol/l

B. Glukose

Glukose bildet durch Auto-Oxidation große Mengen an ROS und Glyoxal (Abbildung 23). Letzte­res bindet an die Aminogruppe der Proteine, was zum Auftreten von Carboxymethyl-Lysin-Res­ten („gealterten Proteinen“) führt. Diese besitzen die Fähigkeit, Kupfer zu binden und die Lipidperoxidation in Gang zu setzen, was wiederum einen Anstieg der Glyoxal-Produktion zur Folge hat. Glukose selbst kann in Kombination mit Hämoglobin glykosyliertes Hämoglobin bil­den. Ein Anstieg dieser Marker findet sich bei Patienten mit Diabetes mellitus, einer Erkrankung die eindeutig mit einem ausgeprägten oxidativen Stress einhergeht (58). Die genannten Marker können sich aber auch im Rahmen des Alterungsprozesses im Organismus anreichern.

Normwerte der Plasmakonzentrationen: 0,60 bis 1,10 g/l

C. Die Myeloperoxidase

Die Aktivierung neutrophiler Granulozyten geht mit einem Anstieg ihres Sauerstoffverbrauchs um 400 % einher. Dieser Umstand hat eine massive Produktion von ROS und die Freisetzung proteolytischer Enzyme (Elastase) sowie der Myeloperoxidase (MPO) zur Folge. Letztere spielt beim Auftreten von oxidativem Stress eine Rolle, da ihre enzymatische Aktivität für die Bildung von Hypochlorsäure, einer Substanz mit starker oxidativer Kapazität verantwortlich ist. Ein erhöhter MPO-Plasmaspiegel ist daher ein spezifischer Marker für eine Neutrophilen-Aktivierung und damit indirekt für eine ROS-Bildung, die sich bei allen entzündlichen Phänomenen beob­achten lässt (59).

Normwerte der Plasmakonzentrationen: 170 – 498 µg/l

D. Das Fettsäureprofil

Unsere Nahrung enthält große Mengen an mehrfach ungesättigten Omega-6- Fettsäuren (Linol­säure und Arachidonsäure). Diese Verbindungen oxidieren in Gegenwart von ROS leicht und bilden Lipidperoxide. Außerdem führt der Stoffwechsel dieser Fettsäuren zur Bildung pro-inflammatorischer Prostaglandine (Abbildung 24). Dagegen enthält unser Speiseplan wenig Fisch, der im Gegensatz zu Fleisch reich an mehrfach ungesättigten Omega-3-Fettsäuren (Alpha-Linolensäure und Docosahexansäure) ist. Letztere werden weniger leicht peroxidiert und ihr Stoffwechsel führt zur Bildung antiinflammatorischer Prostaglandine. Die Wissenschaftler sind sich einig, dass das Verhältnis der Omega-6/Omega-3-Zufuhr nicht über 4/1 bis 8/1 liegen darf. In der westlichen Welt sind wir jedoch weit von diesen Werten entfernt. De Lorgeril et al. zeigten, dass eine an Alpha-Linolensäure-reiche kretische Ernährung bei Patienten, die einen Myokardinfarkt erlitten haben, kardiovaskuläre Rezidive um mehr als 70 % senken kann (60).

IV. Welches ist der beste Marker für oxidativen Stress?

Die Antwort ist einfach: Es gibt keinen!

Seit Beginn der Forschung zum oxidativen Stress sind die Wissenschaftler von der Suche nach einem Biomarker besessen, der sich in unterschiedlichen experimentellen und klinischen Situa­tionen als eindeutiger Indikator für oxidativen Stress erweisen würde. Die Bestimung von Malonaldehyd (MDA) als Marker der Lipidoxidation wurde über lange Zeit als Referenztest betrachtet. Leider mangelte es dem Nachweis von MDA mittels Thiobarbitursäure (TBAR) an Spezifität. Der Test unterlag zudem zahlreichen Artefakten. Die Ergebnisse dieses einfachen Tests führten zu zahlreichen Fehlinterpretationen, die den oxidativen Stress in der Human­medizin zum Teil in Verruf brachten. Erst Mitte der 80er Jahre wurden neue zuverlässigere Methoden für den Nachweis von oxidativem Stress in vivo eingesetzt. Derzeit gibt es mehr als 80 potentiell nutzbare Testverfahren, aber nur gut 30 von ihnen sind für die klinische Routine geeignet. Jede dieser Methoden hat ihre eigenen Besonderheiten und Grenzen. Aus diesem Grund ist es utopisch, oxidativen Stress auf der Grundlage eines einzigen Tests nachweisen zu wollen, auch wenn dieser aufgrund seiner schnellen Durchführbarkeit auf attraktive Weise beworben wird. Es ist wichtig, den in der Vergangenheit bei der MDA-Bestimmung begangenen Fehler nicht noch einmal zu machen.

Um die Untersuchungsmethoden kritisch bewerten zu können, ist demnach eine eingehende Kenntnis der wissenschaftlichen Literatur erforderlich (61). Die korrekte Beurteilung von oxidati­vem Stress ist damit nur auf der Grundlage einer ganzen Batterie von Tests möglich, die sich gegenseitig ergänzen. Die Hauptuntersuchungsachsen beziehen sich auf:

1. Die Analyse der Antioxidantien
2. Die Bestimmung von Spurenelementen
3. Den Nachweis oxidativer Schäden an Lipiden, Proteinen, Lipoproteinen, DNA und Glukose
4. Den Eisenstoffwechsel.

Bei der Wahl der durchzuführenden Bestimmungen fühlen sich Ärzte häufig etwas hilflos. PROBIOX SA sieht es als eine seiner Aufgaben an, Hilfestellungen für diese Wahl zu geben. Unsere wissenschaftliche und klinische Erfahrung hat uns gelehrt, dass je nach vorliegender physiologischer oder pathologischer Situation einige Marker aussagekräftiger sind als andere. PROBIOX SA bietet aus diesem Grund unterschiedliche Beurteilungsprofile für den oxidativen Stress an. Dabei werden die ausgewählten Analysen genau auf die unterschiedlichen Erkran­kungen, bei denen oxidativer Stress eine Rolle spielt, abgestimmt (Patent angemeldet).

V. Sofortige Behandlung der Blutproben und Kühlkette: zwei essen­tielle Anforderungen für qualitative hochwertige Ergebnisse

Die Interpretation der vorgeschlagenen Beurteilungsprofile für den oxidativen Stress darf nur auf der Grundlage besonders sorgfältig verarbeiteter Blutproben erfolgen. Die allermeisten der vor­geschlagenen Analysemethoden für den oxidativen Stress reagieren sehr empfindlich auf die Lagerungsbedingungen der Blutprobe (Art des Antikoagulantiums, Temperatur, etc.). Ein Bei­spiel hierfür ist die Bestimmung von reduziertem und oxidiertem Glutathion. Abbildung 25 zeigt die Ergebnisse für diese beiden Marker bei Bestimmung nach Aufbewahrung der Blutprobe bei Raumtemperatur über 1 Stunde oder mehr. In diesem Fall lässt sich eine qualitativ hochwertige und aussagekräftige Analyse nur bei sofortigem Kontakt des Blutes mit Stabilisatoren und sofor­tigem Einfrieren (T0) erreichen.

Diese Beobachtungen gelten ganz allgemein für alle Marker für oxidativen Stress. Abbildung 26 zeigt, dass die Konservierungs-Kinetik von oxidierten Lipoproteinen (oxidierte LDL) sehr schwankend ist, und zwar auch dann, wenn Vollblutproben bei +4°C gelagert wurden. Die einzige Möglichkeit, ein aussagekräftiges Ergebnis zu erzielen, ist die sofortige Zentrifugation der Blutprobe mit Einfrieren des Plasmas bei – 20°C.

Wissenschaftler müssen bei der Veröffentlichung von Ergebnissen zu Plasmamarkern des oxidativen Stress (z.B. Vitamin E) unter dem Abschnitt „Material und Methode“ des Artikels im Einzelnen aufführen, dass die Blutproben sofort zentrifugiert wurden und dass das Plasma anschließend bis zum Analysezeitpunkt des betreffenden Markers bei –20°C gelagert wurde. PROBIOX SA erwartet, dass diese Anweisungen strikt eingehalten werden und stellt den Nutzern daher ein sehr detailliertes Protokoll für die Entnahme und Behandlung der Blutproben sowie ihren Transport zum Labor in geeigneten Behältnissen auf Trockeneis zur Verfügung.

VI. Ausblick auf die Zukunft: Genomik und Proteomik

PROBIOX SA setzt sich auch für die Entwicklung dieser neuen Methoden ein, um ein besseres Verständnis der Bedeutung von oxidativem Stress für die Entstehung unterschiedlicher Erkran­kungen zu erhalten. Diese Methoden könnten gegenüber den klassischen Analysen neue Infor­mationen zu den Ursachen von oxidativem Stress und über die Art von Organ, die im Besonderen mit einer Überproduktion von ROS konfrontiert ist, liefern.

Eine der neuesten und aufregendsten Entwicklungen auf dem Gebiet des oxidativen Stresses ist die Erkenntnis, dass die Regulation der Expression von Genen und Proteinen als Reaktion auf oxidativen Stress unterschiedlich ausfällt. Bei der Methode der Real-Time-Polymeraskettenreak­tion (Real-Time-PCR) wird aus Zellen isolierte RNA mit Hilfe einer reversen Transkriptase in DNAc umgewandelt. Anschließend wird die DNAc des untersuchten Gens mit Hilfe von zwei Primern und einer Polymerase verstärkt. Der Nachweis der Verstärkung erfolgt in Realzeit mit Hilfe einer speziellen fluoreszierenden Sonde. In neuerer Zeit wurden DNA-Chips (Microarrays) eingeführt. Sie bieten den Vorteil, dass es auf diese Weise möglich ist auf einen Blick Unter­schiede in der Expression mehrerer hundert für oxidativen Stress kodierender Gene darzustellen (62), und das für das gesamte menschliche Genom. Der Chip wird hergestellt, indem DNAc-Fragmente (die den untersuchten Genen entsprechen), die zuvor mittels PCR (Polymeraseket­tenreaktion) verstärkt wurden, auf eine Glasplatte aufgebracht werden. Die DNAc wird anschließend zu einer Einzelstrang-DNA denaturiert, so dass sie mit einem komplementären Strang in der Sonde oder der Zielstruktur (Zellen, Gewebestücke) hybridisieren kann. Aus Zel­len, die oxidativem Stress ausgesetzt wurden (Test) oder nicht (Kontrolle), wird RNA extrahiert, die durch eine reverse Transkriptase in DNAc überführt wird. Die DNAc der Kontrollzellen wird mit einem grünen fluoreszierenden Farbstoff und die DNAc der einem oxidativen Stress ausge­setzten Zellen mit einem roten Fluorochrom markiert. Bei der Hybridisierung wird die DNA der beiden Zellen gemischt und auf den Chip gelegt, der dann über Nacht bei 42 ° C inkubiert wird. Auf diese Weise kann die DNAc der Sonde mit der komplementären DNAc auf dem Chip hybri­disieren und eine Doppelstrang-DNAc bilden. Eine Aufnahme der Platte nach der Hybridisierung liefert dann eine Fluoreszenz, deren Intensität den grünen und roten Signalen entspricht. Das Verhältnis zwischen roten und grünen Signalen ist 1 wenn die RNA eines untersuchten Gens in der Kontroll- und Testprobe in gleicher Menge vorhanden ist. Werte oberhalb von 1 zeigen an, dass es zu einer Überexpression des Gens gekommen ist, während Werte unterhalb von 1 auf eine Unterexpression des Gens hinweisen (Abbildung 27).

VII. Schlussfolgerung

Es ist heute anerkannt, dass ROS ausgeprägte Zellschäden hervorrufen, die zur Funktions­einbußen von Organen führen können. Vor diesem Hintergrund wird der oxidative Stress immer mehr mit dem Alterungsprozess, dem Auftreten klinischer Komplikationen sowie der Entstehung von Erkrankungen des Alters (Atherosklerose, Krebs, neurodegenerative Erkrankungen) in Zusammenhang gebracht. Mit der Diagnostik von oxidativem Stress und therapeutischen Maßnahmen zur Begrenzung seiner schädlichen Auswirkungen eröffnet sich ein wichtiges neues Forschungsgebiet. Angemessen angewandt sollte diese neue Disziplin die Medizin von Morgen revolutionieren und große wirtschaftliche Auswirkungen für die Gesundheitsversorgung haben. Dafür sind leistungsfähige und spezifische Analysemethoden erforderlich. Während die ersten Laboruntersuchungen zum oxidativen Stress allein auf der Bestimmung von Malonaldehyd als In-vivo -Marker der Lipidperoxidation basierten, konnten wir in den letzten fünf Jahren eine wahre Explosion von Methoden erleben, die eine Beurteilung des oxidativen Stress-Status bei einer Person in der klinischen Routine ermöglichen. Alle diese Methoden weisen ohne Ausnahme Begrenzungen auf und lassen allein keine Aussagen über den oxidativen Stress-Status zu. Aus diesem Grund ist es erforderlich, Testbatterien einzusetzen, die jedoch geeignet zusammen­gestellt sein müssen, da sich oxidativer Stress je nach der angetroffenen physiologischen oder pathologischen Situation unterschiedlich manifestiert. Vor diesem Hintergrund hat PROBIOX SA Beurteilungsprofile für den oxidativen Stress patentiert, die an diese Situationen angepasst sind. Darüber hinaus achten die Wissenschaftler von PROBIOX SA besonders auf die Entnahme und Behandlung der Blutproben, da die meisten der untersuchten Substanzen nur wenig stabil sind. Die sofortige Zentrifugation der Blutproben nach der Entnahme, aber auch der Erhalt der Kühl­kette für Plasma und Seren bis zur Analyse der Proben sind zwei (erfüllbare) Erfordernisse und die wichtigsten Garanten für qualitativ hochwertige Ergebnisse (siehe Probiox-Qualitätscharta). Auf diese Weise wird eine bestmögliche Interpretation der Ergebnisse ermöglicht, in die über 20 Jahre akademischer wissenschaftlicher Erfahrung auf dem Gebiet des oxidativen Stresses ein­fließen.

Die hier vorgestellte wissenschaftliche Methode wird Ärzten und verwandten Berufsgruppen zum Beispiel den Nachweis möglicher Abweichungen der Antioxidantien-Konzentrationen von den Normwerten erlauben. Diese Abweichungen können dann über eine gesündere Ernährung oder geeignete Supplementierung korrigiert werden. Die modernen Techniken der Genomik und Proteomik, mit denen sich die F&E-Abteilung von PROBIOX SA beschäftigt, werden unser Wissen über den oxidativen Stress vertiefen und sollten bessere und individuellere Korrekturen ermöglichen, durch die sich die schädlichen Auswirkungen des oxidativen Stresses vermindern lassen.

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